Un poco de historia

Aunque en nuestra mente prevalece la idea de que el método de referencia es el método manual, basado en la observación visual y recuento de plaquetas en la cámara de Neubauer, es una creencia del la prehistoria del laboratorio de hematología.

Aunque el método visual, realizado en un microscopio de contraste de fase, que permite distinguir mucho mejor a las plaquetas, fue una método recomendado, esto al menos desde 1988 no es así.

Existen otros métodos, como el método indirecto basado en el recuento de eritrocitos, que requiere obtener la relación entre eritrocitos y plaquetas, a partir de una medición en un citométro de flujo, previo marcado de las plaquetas, y un recuento de eritrocitos realizado bajo principio de impedancia.

Realmente se trata de un método seleccionado, es decir un nivel intermedio entre uno de rutina y uno de referencia. Esta situación fue la que llevo al desarrollo de un método de referencia real para el recuento de plaquetas.

En el año 2001, se publica una nueva versión del método de referencia para el recuento plaquetario, producto del consenso del panel de experto en citometría del Concejo Internacional de Estandarización en Hematología (ICSH, por sus siglas en inglés) y el grupo especial en recuento de plaquetas de la Sociedad Internacional de Hematología (ISH, por sus siglas en inglés).

El método ha sido bautizado como método de la razón eritrocitos/plaquetas. Es un método bastante extraño que utiliza la medición de plaquetas y de eritrocitos para obtener el recuento de plaquetas de referencia, aunque realmente es una nueva versión, pero apoyada en mejor tecnología.

International Council for Standardization in Haematology Expert Panel on Cytometry; International Society of Laboratory Hematology Task Force on Platelet Counting. Platelet counting by the RBC/platelet ratio method. A reference method. Am J Clin Pathol. 2001 Mar;115(3):460-4. doi: 10.1309/w612-myep-fa7u-8uya. PMID: 11246942.

Método de referencia

Para entenderlo mejor, hay que separar en tres lo que se realiza:

• Obtención de la relación eritrocitos/plaquetas
• Obtención del recuento de eritrocitos,
• Obtención del recuento de plaquetas de referencia.

Relación de eritrocitos / plaquetas

Se realiza en un citómetro de flujo, previo marcado fluorescente de las plaquetas.

Las plaquetas son marcadas con al menos dos anticuerpos monoclonales dirigidos contra sendos antígenos de superficie.

Se utiliza el complejo de la glicoproteína IIb/IIIa y los anticuerpos monoclonales anti-CD41 y anti-CD61. El colorante fluorescente empleado es la fluoresceina.

La razón de marcar las plaquetas es justamente separarlas de los interferentes que pueden ser contados como plaquetas por tener un volumen similar, tales como detritos, señales ruido y principalmente eritrocitos de pequeño volumen.

Al marcar la plaqueta se pretende asegurar que lo que se miden son únicamente plaquetas.

Sin embargo los resultados indican que, en algunas muestras se marcan con los dos anticuerpos, mientras que en otras predomina el marcado con uno solo de los anticuerpos. Y esta es la causa por la cual se requiere emplear dos anticuerpos.

Otras causas que pueden influir en el marcado de las plaquetas, son trastornos plaquetarios en el paciente en los que se puede bloquear los sitios de unión de los anticuerpos, tales como trastornos del tipo inmune, falta del complejo IIb/IIa (tromboastemia de Glanzmann) y otras que suelen interferir en el recuento de plaquetas como la agregación, restos celulares o esquistocitos.

Hay que tener presente que el método de referencia es empleado para valorar a los materiales de calibración, en los que evita este tipo de pacientes.

La muestra una vez marcada se procesa por un citómetro de flujo con capacidad de medir el colorante fluorescente y la dispersión de luz láser, para obtener el volumen celular.

Con lo cual se suele obtener un gráfico que permite distinguir las plaquetas de los eritrocitos. Aunque, existe una zona en la que ambos elementos coinciden.

El citómetro debe contar al menos 50.000 eventos y un mínimo de 1.000 plaquetas. Recordemos que aquí se están contando los eritrocitos (que son mayoría) y las plaquetas marcadas. De esta forma obtendremos los eventos que son plaquetas (PLQeventos) y los que son eritrocitos (GReventos).

Existe una zona gris de coincidencia entre plaquetas y eritrocitos, el número de estos eventos debe ser añadido a las plaquetas y de eritrocitos, para obtener los recuentos por el citómetro de plaquetas (#PLQcit) y eritrocitos (#GRcit).

Te lo puedo resumir así:

#PLQcit = PLQeventos + Eventos de coincidencia

#GRcit = GReventos + Eventos de coincidencia

Al realizar una dilución 1:1000 de la muestra, se disminuye en gran media el error por coincidencia. Por ello se emplea dicha dilución final de la muestra.

Por último se obtiene la razón o relación (R) entre los eventos de los eritrocitos y los eventos de plaquetas obtenidos en el citómetro.

R = #GRcit / #PLQcit

Algo interesante es que la razón GR/PLQ suele ser un número bastante poblacional que ronda los 20.

Refieren que en un grupo de 357 individuos aparentemente sanos, con una mezcla de razas, sexo y edad media de 26 años, el valor obtenido de R fue 21,572 ±5,134.

Recuento de eritrocitos

Lo que se hace es que se miden los eritrocitos en un contador monocanal que emplea el principio de impedancia, para obtener el recuento más exacto posible de eritrocitos, justamente lo que es el método de referencia para el recuento de eritrocitos.

El recuento de eritrocitos será la base para obtener el recuento de plaquetas de referencia.

Obtención del recuento de plaquetas de referencia

La idea es muy sencilla, a partir del recuento de eritrocitos de referencia (#GRref) se obtiene el recuento de plaquetas de referencia (#PLQref) de forma indirecta. Simplemente se divide el recuento de eritrocitos de referencia entre una razón llamada R.

#PLQref = #GRref / R

R es simplemente el cociente entre los eventos atribuibles a los eritrocitos obtenidos en el citómetro (#GRcit), entre los eventos de plaquetas obtenido en el citómetro (#PLQcit).

El artículo nos brinda un ejemplo

#GRref = 5,44 x 10¹²/l

R: 20,4896

#PLQref = #GRref / R

#PLQ ref = 5,44 x 10¹²/l / 20,4896

#PLQref = 265,5 x 10⁹/L

El recuento de plaquetas de referencia es 265,5 x 10⁹/L.

Precisión

Recodemos que por definición un método de referencia es veraz (según el VIM), es decir que su error sistemático es cero.

Sin embargo la precisión es algo natural de un método, en este caso para una razón GR/PLQ de 20 y contando al menos 50,000 eventos en el citómetro el error aleatorio teórico de método de referencia es del 2,0%.

En la practica la precisión intracorrida es del 1,7% para recuentos de 280 x10⁹/L y de 3,0% para recuentos de 40 x10⁹/L, una maravilla, sobre todo en trombocitopenia, por lo que provocan llevarlo a la rutina para obtener unos resultados mucho más confiables, y esto es justamente lo que destaca el ICSH.

Pero te has dado cuento de lo complejo y costoso en tiempo y dinero que es su realización. Pero existen algunas alternativas de métodos inmunológicos que dan buenos resultados.

Puntualizando

Al final, las plaquetas representa una porción del recuento de eritrocitos de referencia, o lo que es lo mismo una razón GR/PLQ.

Lo más sorprendente de todo, es que un método indirecto es el método de referencia para el recuento de plaquetas. Algo común en los métodos de referencia de los parámetros principales del hemograma.

Los detalles del método de referencia lo puedes encontrar en la publicación. Si alguna vez lo realizas, comparte tu experiencia con nosotros.

Saludos
Alfredo Gallardo Acevedo
22 de julio de 2021

Actualizado el 26 de enero de 2023