Método de referencia para el recuento de plaquetas

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Un poco de historia

Aunque en nuestra mente prevalece la idea de que el método de referencia es el método manual, basado en la observación visual y recuento de plaquetas en la cámara de Neubauer, es una creencia del la prehistoria del laboratorio de hematología.

La penúltima versión de un método de referencia para plaquetas data de 1988 y ciertamente empleaba el método visual, realizado en un microscopio de contraste de fase, que permite distinguir mucho mejor a las plaquetas. Pero además, requería el recuento de plaquetas y de eritrocitos obtenidos por un instrumento que realizara una medición por impedancia y contara con un enfoque hidrodinámico. Con estos se obtenía la razón eritrocitos/plaquetas y de ella el recuento de plaquetas de referencia.

Realmente se trata de un método seleccionado, es decir un método de rutina llevado a un nivel intermedio entre uno de rutina y uno de referencia. Esta situación fue la que llevo al desarrollo de un método de referencia real para el recuento de plaquetas.

En el año 2001, se publica una nueva versión del método de referencia para el recuento plaquetario, producto del consenso del panel de experto en citometría del Concejo Internacional de Estandarización en Hematología (ICSH, por sus siglas en inglés) y el grupo especial en recuento de plaquetas de la Sociedad Internacional de Hematología (ISH, por sus siglas en inglés).

El método ha sido bautizado como método de la razón eritrocitos/plaquetas. Es un método bastante extraño que utiliza la medición de plaquetas y de eritrocitos para obtener el recuento de plaquetas de referencia, aunque realmente es una nueva versión, pero apoyada en mejor tecnología.

International Council for Standardization in Haematology Expert Panel on Cytometry; International Society of Laboratory Hematology Task Force on Platelet Counting. Platelet counting by the RBC/platelet ratio method. A reference method. Am J Clin Pathol. 2001 Mar;115(3):460-4. doi: 10.1309/w612-myep-fa7u-8uya. PMID: 11246942.

Método de referencia

Para entenderlo mejor, hay que separar el recuento de eritrocitos por un lado, el de plaquetas por otro y luego aplicar la razón eritrocitos/plaquetas.

Recuento de eritrocitos

Lo que se hace es que se miden los eritrocitos en un contador monocanal que emplea el principio de impedancia, para obtener el recuento más exacto posible de eritrocitos, justamente lo que es el método de referencia.

El recuento de eritrocitos será la base para obtener el recuento de plaquetas de referencia.

Recuento de plaquetas

Se realiza en un citómetro de flujo, previo marcado fluorescente de las plaquetas.

Las plaquetas son marcadas con al menos dos anticuerpos monoclonales dirigidos contra sendos antígenos de superficie. Se utiliza el complejo de la glicoproteína IIb/IIIa y los anticuerpos monoclonales CD41 y CD61. El colorante fluorescente empleado es la fluoresceina.

La razón de marcar las plaquetas es justamente separarlas de los interferentes que pueden ser contados como plaquetas por tener un volumen similar, tales como detritos, señales ruido y principalmente eritrocitos de pequeño volumen.

Al marcar la #plaqueta se pretende asegurar que lo que se miden son únicamente plaquetas. #HemaLab Clic para tuitear

Sin embargo los resultados indican que, en algunas muestras se marcan con los dos anticuerpos, mientras que en otras predomina el marcado con uno solo de los anticuerpos. Y esta es la causa por la cual se requiere emplear dos anticuerpos.

Otras causas que pueden influir en el marcado de las plaquetas, son trastornos plaquetarios en el paciente en los que se puede bloquear los sitios de unión de los anticuerpos, tales como trastornos del tipo inmune, falta del complejo IIb/IIa (tromboastemia de Glanzmann) y otras que suelen interferir en el recuento de plaquetas como la agregación, restos celulares o esquistocitos. Sin embargo, hay que tener presente que el método de referencia es empleado para valorar a los materiales de calibración, en los que evita este tipo de pacientes.

La muestra una vez marcada se procesa por un citómetro de flujo con capacidad de medir el colorante fluorescente y la dispersión de luz láser, para obtener el volumen celular. Con lo cual se suele obtener un gráfico que permite distinguir las plaquetas de los eritrocitos. Sin embargo, existe una zona en la que ambos elementos coinciden.

El citómetro debe contar al menos 50.000 eventos y un mínimo de 1.000 plaquetas. Recordemos que aquí se están contando los eritrocitos (que son mayoría) y las plaquetas marcadas. De esta forma obtendremos los eventos que son plaquetas (PLQeventos) y los que son eritrocitos (GReventos). Sin embargo la zona gris de coincidencia entre plaquetas y eritrocitos, el número de estos eventos debe ser añadido a las plaquetas y de eritrocitos, para obtener los recuentos por el citómetro de plaquetas (#PLQcit) y eritrocitos (#GRcit).

Te lo puedo resumir así:

#PLQcit = PLQeventos + Eventos de coincidencia

#GRcit = GReventos + Eventos de coincidencia

Método de referencia del recuento de plaquetas. Eje x volumen celular, eje y anticuerpos monoclonales contra plaquetas. En rojo las plaquetas, en verde los eritrocitos y morado las eventos que coinciden. Sehgal K y cols, 2010.

Obtención del recuento de plaquetas de referencia

La base para obtener el recuento de #plaquetas es el recuento de #eritrocitos de referencia. #HemaLab Clic para tuitear

La idea es muy sencilla, a partir del recuento de eritrocitos de referencia (#GRref) se obtiene el recuento de plaquetas de referencia (#PLQref) de forma indirecta. Simplemente se divide el recuento de eritrocitos de referencia entre una razón llamada R.

#PLQref = #GRref / R

R viene del recuento que hemos realizado en el citómetro. Y es simplemente el cociente entre el recuento de eritrocitos obtenidos en el citómetro (#GRcit), entre el recuento de plaquetas obtenido en el citómetro (#PLQcit).

R = #GRcit / #PLQcit

El artículo nos brinda un ejemplo

#GRref = 5,44 x 1012/l

R: 20,4896

#PLQref = #GRref / R = 5,44 x 1012/l / 20,4896 = 265,5 x 109/L

El recuento de plaquetas de referencia es 265,5 x 109/L.

Algo interesante es que la razón GR/PLQ suele ser un número bastante poblacional que ronda los 20. Refieren que en un grupo de 357 individuos aparentemente sanos, con una mezcla de razas, sexo y edad media de 26 años, el valor obtenido de R fue 21,572 ±5,134.

Precisión

Recodemos que por definición un método de referencia es exacto o veraz (según el VIM), es decir que su error sistemático es cero.

Sin embargo la precisión es algo natural de un método, en este caso para una razón GR/PLQ de 20 y contando al menos 50,000 eventos en el citómetro el error aleatorio teórico es del 2,0%.

En la practica la precisión intracorrida es del 1,7% para recuentos de 280 x109/L y de 3,0% para recuentos de 40 x109/L, una maravilla, sobre todo en trombocitopenia, por lo que provocan llevarlo a la rutina para obtener unos resultados mucho más confiables, pero te has dado cuento de lo complejo y costoso en tiempo y dinero que es su realización.

Puntualizando

Al final, las plaquetas representa una porción del recuento de eritrocitos de referencia, o lo que es lo mismo una razón GR/PLQ. Lo más sorprendente de todo, es que un método indirecto es el método de referencia para el recuento de plaquetas. Algo común en los métodos de referencia de los parámetros principales del hemograma.

Los detalles del método de referencia lo puedes encontrar en la publicación. Si alguna vez lo realizas, comparte tu experiencia con nosotros.

Saludos
Alfredo Gallardo Acevedo
22 de julio de 2021

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